一、平台简介

华中科技大学同济医学院生殖健康研究所于2016年8月建立模式生物斑马鱼实验平台。斑马鱼（Danio rerio）广泛应用于发育生物学、基因组学、毒理学研究领域，目前已成为继小鼠、大鼠之后，世界第三受科研工作者重视的模式生物。本单位建立的模式生物斑马鱼实验平台，一方面旨在以斑马鱼胚胎作为模型，利用其胚胎体外受精、体外发育、胚体透明、便于实时观察胚胎发育和器官形成等优势，从环境因素和遗传因素等方面开展影响胚胎早期发育的分子机制研究，以期在解决人类早期胚胎发育异常所导致的不育、自发流产和先天出生缺陷等问题上取得重大突破；另一方面，以斑马鱼成鱼为模型，研究遗传、环境以及感染等因素对鱼类生殖能力的影响，揭示这些因素参与调控生育力的分子机制。

目前该平台的斑马鱼养殖系统可同时容纳2000余尾成年斑马鱼，充分满足遗传学和毒理学研究用鱼需求。平台工作人员已熟练掌握基于转座系统的转基因斑马鱼品系研制技术、基于CRISPR/Cas9技术的斑马鱼基因敲除技术，可为生殖与发育相关疾病的机制研究提供在体模型。

                           图1 平台概况

二、可提供的服务

1. CRISPR/Cas9介导的敲除服务

1.1 简介

基因敲除技术是人为地使靶基因的序列发生碱基对的增添、缺失或替换，引起的靶基因结构的改变，以达到定点修饰改造特定基因的目的。基因敲除技术是反向遗传学研究中最重要的技术工具。基因敲除斑马鱼广泛应用于遗传学、发育生物学、细胞生物学、环境毒理学等研究领域。目前该平台可提供CRISPR/cas9技术介导的斑马鱼基因敲除技术服务。

1.2服务内容

（1）经双方商议确定技术细节进行载体构建。包括设计与合成gRNA（一周）。

（2）胚胎显微注射及突变检测。平台向斑马鱼胚胎注射gRNA-cas9 mRNA复合物。鉴定注射的胚胎群体是否产生靶向突变，如有，将P0代突变斑马鱼培养至性成熟（3个月）。

（3）筛选出能传递目的基因敲除的P0代斑马鱼，与野生型斑马鱼杂交（或同一基因型P0代自交），建立F1代（一周）。

（4）将F1代突变斑马鱼培养至2月龄（能够剪尾鳍进行逐尾鉴定），鉴定目的基因成功敲除的F1代并标注敲除的基因型，交付委托方（3个月）。

图2 CRISPR/cas9基因敲除流程和成功案例

2. 基于转座系统的转基因斑马鱼服务

2.1简介

利用高效的转座子系统，构建转座子系统介导的转基因载体，经显微注射获得携带转植基因的斑马鱼品系。

2.2 服务内容

（1）委托方提供基础转基因载体，我们进行载体改造（加入高效转座子元件）、制备和纯化（2周）。

（2）胚胎显微注射，观察P0代转基因胚胎的表型，与预期表型进行对照（1周）。

（3）将P0代转基因斑马鱼培养至性成熟，筛选出能将转基因传递给子代的P0代转基因斑马鱼（3个月）。

（4）将能够传递转基因的P0斑马鱼与野生型斑马鱼杂交建立F1代，鉴定F1代斑马鱼的基因型，及阳性F1代转基因斑马鱼胚胎的表型特征（2周）。

（5）将F1代斑马鱼培养至2月龄（能够剪尾鳍进行逐尾鉴定），鉴定转基因阳性的F1代个体，交付委托方（3个月）。

图3基于转座系统的转基因斑马鱼流程和成功案例

3. 提供用于毒理学实验的野生型斑马鱼胚胎

3.1简介

斑马鱼胚胎发育对环境因子的敏感性，所用化合物少，可以检测难以获得的环境样品毒性。斑马鱼胚胎透明，发育速度快，易于在体式显微镜下观察环境污染物对胚胎发育和器官形成的影响。斑马鱼受精后24小时即可发育成形，受精后5dpf，所有器官均以形成。通过对各个时期的毒理学终点指标的统计和分析，可以迅速判断环境污染物的毒理学效应。因此，斑马鱼胚胎是检测环境污染物胚胎毒性的理想模型。

3.2 服务内容

根据实验需求，单次可提供100~1000颗斑马鱼胚胎用于胚胎毒性的毒理学实验（2天）。

三、服务流程

1. 委托方与平台联系人沟通实验需求，商议评估平台是否可提供委托方的需求；

2. 如可提供相关服务，委托方填写斑马鱼平台服务使用申请表，由相关负责人审核签字；

3. 委托方与平台技术人员商议细节，拟定技术服务合同，由委托方与相关负责人签字生效；

4. 平台按合同执行相关服务，按时交付。

四、平台联系方式

联系人：刘春艳

邮箱：lchy2019@hust.edu.cn